Ruprecht von Pfalz-Mosbach entstammte der pfälzischen Linie des Hauses Wittelsbach als Sohn des Pfalzgrafen Otto I. von Pfalz-Mosbach und der Johanna von Bayern-Landshut. Als nachgeborener Sohn war er für eine geistliche Laufbahn bestimmt, die ihn in die höchsten Kreise der Reichskirche führte.

Seine Ausbildung erhielt er unter anderem an den Universitäten von Heidelberg und Pavia, was seine juristische und theologische Gelehrsamkeit begründete. Frühzeitig mit Pfründen ausgestattet, stieg er zum Dompropst in Mainz auf und wurde schließlich zum Bischof von Regensburg gewählt. In dieser Funktion sah er sich mit den komplexen kirchenpolitischen Herausforderungen seiner Zeit konfrontiert, darunter die Reformbestrebungen innerhalb der Diözese und die wirtschaftliche Konsolidierung des Hochstifts.

Besondere Bedeutung erlangte Ruprecht durch seine Vermittlerrolle zwischen den verschiedenen Linien des Hauses Wittelsbach und dem Kaiserhaus. Er galt als enger Vertrauter Kaiser Friedrichs III. und nahm regelmäßig an Reichstagen teil, wo er die Interessen seines Standes und seiner Familie vertrat. Trotz seiner geistlichen Würde blieb er den weltlichen Belangen seiner Mosbacher Verwandten eng verbunden und unterstützte seinen Bruder Otto II. bei Regierungsgeschäften. Da er als Geistlicher zölibatär lebte, hinterließ er keine legitimen Nachkommen, wirkte jedoch durch Stiftungen und kirchenrechtliche Reformen nachhaltig in seinem Bistum.