Margarethe von Pfalz-Mosbach entstammte der pfälzischen Linie des Hauses Wittelsbach als Tochter des Pfalzgrafen Otto I. von Pfalz-Mosbach und der Johanna von Bayern-Landshut. Durch ihre Abstammung vereinte sie zwei bedeutende Zweige der wittelsbachischen Dynastie und war eng mit den führenden Fürstenhäusern des Heiligen Römischen Reiches vernetzt.

Ihre Vermählung mit Graf Reinhard IV. von Hanau-Münzenberg war von hoher politischer Relevanz für die Konsolidierung der Grafschaft Hanau. Als Mitgift brachte sie eine beträchtliche Summe sowie territoriale Ansprüche in die Verbindung ein, was die Position ihres Gemahls im rhein-mainischen Raum stärkte. Aus der Ehe gingen mehrere Kinder hervor, darunter der spätere Graf Philipp II. von Hanau-Münzenberg, womit Margarethe zur Stammmutter der weiteren Linie dieses Hauses wurde.

Nach dem frühen Tod ihres Ehemanns übernahm sie eine aktive Rolle bei der Sicherung des Erbes für ihre minderjährigen Söhne. In den darauffolgenden Jahren zog sie sich in ihren Witwensitz zurück, blieb jedoch eine respektierte Figur innerhalb der weitverzweigten Verwandtschaft der Pfälzer Wittelsbacher. Ihr Leben steht beispielhaft für die Rolle hochadliger Frauen des 15. Jahrhunderts, die durch strategische Heiraten und dynastische Loyalität den Fortbestand ihrer Familienzweige sicherten.