Barbara von Pfalz-Zweibrücken-Neuburg entstammte dem Haus Wittelsbach und wurde als Tochter des Herzogs Wolfgang von Zweibrücken und der Landgräfin Anna von Hessen geboren. Durch ihre Vermählung mit Graf Gottfried zu Oettingen-Oettingen wurde sie Gräfin der gleichnamigen Grafschaft. Ihre einzige Tochter aus dieser Verbindung verstarb bereits im Säuglingsalter.

Besondere historische Bedeutung erlangte die Pfalzgräfin durch ihr tiefgreifendes Interesse an den Naturwissenschaften ihrer Zeit. Sie widmete sich intensiv alchemistischen Studien und Experimenten, was sie zu einer bemerkenswerten weiblichen Figur in der Wissenschaftsgeschichte der Frühen Neuzeit macht. Ihr Ruf als Expertin auf diesem Gebiet führte sie zeitweilig sogar an den Prager Hof Kaiser Rudolfs II., wo sie in dessen Residenz alchemistische Versuche durchführte.

Ihre letzte Ruhestätte fand sie in der Schlosskirche St. Michael auf der Burg Harburg. Dort erinnert ein monumentales Grabmal an sie, das sie gemeinsam mit ihrem Ehemann und dessen erster Gemahlin zeigt. Die Darstellung unterstreicht ihre standesgemäße Einbindung in den hohen Adel sowie ihre bleibende Präsenz in der regionalen Geschichte.